WIWAM高通量植物表型成像分析平臺真菌研究

疥瘡鏈霉菌是一種與常見疥瘡相關(guān)的植物病原菌。這主要歸因于它能夠產(chǎn)生植物毒素thaxtominA，其生物合成由纖維二糖觸發(fā)。在對纖維二糖存在時釋放的其他代謝物的調(diào)查中，我們在含有疥瘡鏈霉菌的thaxtomin提取物中發(fā)現(xiàn)了其他化合物。質(zhì)譜（MS）和核磁共振（NMR）結(jié)構(gòu)分析表明，這些化合物是TOR（雷帕霉素靶點）激酶（TORK）途徑抑制性脂肽rotihibin A的氨基酸序列變體，主要化合物命名為rotihibin C和D。與thaxtomin相反，在葡萄糖存在的情況下也能誘導(dǎo)產(chǎn)生Rotihibin C和D，這表明它們的生物合成受到不同的調(diào)節(jié)。通過靶向蛋白質(zhì)組學的結(jié)合，在S。疥瘡87-22。該簇跨越33kbp，編碼2種不同的非核糖體肽合成酶（NRPSs）和12種附加酶。在其他公開獲得的完整放線菌基因組中發(fā)現(xiàn)了同源rth生物合成基因簇。Rotihibin C和D在低濃度下對小檸檬和擬南芥表現(xiàn)出除草活性，通過監(jiān)測對生長的影響和光系統(tǒng)II的最大光化學效率可以看出。

關(guān)鍵詞：鏈霉菌；TORK；常見痂；脂肽；非核糖體肽；蛋白質(zhì)組學

圖1.纖維二糖對疥瘡鏈霉菌RL-34分泌代謝組的影響

已知纖維二糖可誘導(dǎo)Streptomyces scabies 中 thaxtomin A 的產(chǎn)生。假設(shè)纖維二糖還引發(fā)其他對根和塊莖作物感染很重要的毒力因子的產(chǎn)生。當比較來自在國際鏈霉菌計劃培養(yǎng)基 4 (ISP-4) 中生長的 S.scabies RL-34 培養(yǎng)物的培養(yǎng)基正丁醇提取物的高效液相色譜 (HPLC) 譜時，無論是否添加0.7%纖維二糖，在纖維二糖存在下生長后獲得的提取物的HPLC曲線中出現(xiàn)了新峰（圖 1）。

圖2.蛋白質(zhì)的相對豐度作為非核糖體肽機制的一部分，以響應(yīng)纖維二糖(CB)(Glc2) 或葡萄糖(Glc)供應(yīng)，由靶向蛋白質(zhì)組學(LC-MRM) 確定

除了thaxtomin 生物合成基因簇 (BGC)，S.scabies 還擁有其他四種NRP合酶(NRPS)型BGC；其中兩個是神秘的，即BGC尚未與遺傳物質(zhì)相關(guān)聯(lián)的生物分子。在之前的蛋白質(zhì)組學實驗中發(fā)現(xiàn)了與神秘的NRPS型BGC（從 scab_3221到scab_3351）相關(guān)的蛋白質(zhì)。我們通過使用多反應(yīng)監(jiān)測 (MRM) 的靶向蛋白質(zhì)組學研究了這種BGC與rotihibin產(chǎn)生之間的可能關(guān)系。SCAB_3241、SCAB_3251、SCAB_3281、SCAB_3291、SCAB_3301和SCAB_3321的蛋白型肽用于評估蛋白質(zhì)水平。圖2顯示了葡萄糖或纖維二糖的存在與所選蛋白質(zhì)的產(chǎn)生之間的正相關(guān)，從而提供了第一個證據(jù)，證明輪替抑制素的產(chǎn)生與這種神秘的BGC可能存在聯(lián)系。有趣的是，纖維素利用調(diào)節(jié)因子cebR的失活對該簇的酶的產(chǎn)生沒有影響，甚至對scab_3221 基因產(chǎn)物產(chǎn)生相反的影響(15)。這表明纖維二糖對NRPS基因簇表達的影響不依賴于cebR并且與thaxtomin的產(chǎn)生沒有協(xié)同調(diào)節(jié)。

圖3.RotihibinC對Lemna minor光系統(tǒng)II最大光化學效率的影響

圖4.RotihibinD對Lemna minor光系統(tǒng)II最大光化學效率的影響

此外，本文使用FV/FM比率作為代理評估了rotihibinsC和D對光系統(tǒng)II光化學的影響。在暗適應(yīng)FV/FM測量中，測量的是最小熒光(F0)。接下來，使用強光閃光關(guān)閉（減少）所有反應(yīng)中心并測量最大熒光，稱為FM。FM2F0的差值是FV值。FV/FM比率代表光系統(tǒng)II的最大潛在量子效率。 一般來說，植物壓力越大，可用的開放反應(yīng)中心就越少，這導(dǎo)致FV/FM比率降低。RGB和葉綠素熒光圖像在補充材料中的圖S2至S5中描述。以FV/FM比率為代表，光系統(tǒng)II的最大光化學效率隨著營養(yǎng)培養(yǎng)基中 rotihibin濃度的增加呈下降趨勢，表明rotihibins影響L.minor的光合作用（圖3和圖4）。

圖5.rotihibins C和D對擬南芥的影響

施用后96小時的序數(shù)分析也表明，用0.1mM Rotihibin C和D處理的擬南芥植株的生長和光系統(tǒng)II（FV/FM）（52）的最大光化學效率受到影響（圖5）。在這里，沒有向營養(yǎng)培養(yǎng)基中添加Rotihibin，而是將其噴灑到植物上；這就解釋了與L微量生物測定。大多數(shù)除草劑作為水基噴霧劑使用，這是農(nóng)民保護植物產(chǎn)品的簡單方法。陽性對照品為商用草甘膦制劑（RoundUp Turbo），摩爾濃度約為3m。在較低濃度的rotihibin D（0.05mM和0.005mM）下，觀察到對擬南芥幼苗的生長促進作用，這再次反映了一種激素效應(yīng)（圖6）。